如何设计引物超表达基因的全长引物?

来源：学生作业帮编辑：灵鹊做题网作业帮分类：生物作业时间：2024/04/28 14:10:06

如何设计引物超表达基因的全长引物?
现在我要扩一个基因的全长,用来转染细胞超表达,序列已知,CDS区共1563bp.想问的是,这时候设计引物必须从起始密码子开始,终止密码子结束吗?这种用来超表达的基因引物设计还有什么要注意的?扩出来之后是直接双酶切,还是连接T载体转化之后再酶切?我用的是pCMV-N-FLAG标签真核表达载体.请各位战友多多指教,

您应该使用巢式PCR来做这个实验.
无论您是先提RNA再做反转录,还是直接从DNA中获得基因,考虑到模板的复杂性,都应当使用巢式PCR.建议您先从目的基因的上下游设计一段引物,即外引物,再根据目的基因上下游设计一段内引物.
外引物不在目的基因上,可以在目的基因上下游100bp以内,这就可以利用引物设计软件找出最优秀的引物,提高了第一次PCR的成功率.将第一次PCR产物做模板,进行第二次PCR,这样如果P出了大小正确的条带,就可以肯定是你的目的条带.因为两次特异性扩增再加上大小正确,这样的总特异性是极高的.
另外,由于在第二次PCR过程中,模板是第一次PCR产物,成分单一,就是内引物再糟糕,也没有问题,这就规避了你提到的“那如果在CDS区两端设计不出引物怎么办?”这个问题.
您明白了吗?欢迎追问!

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