平末端连接问题最近在做载体构建,有一个5k左右的片段要连接到一个12k左右的载体骨架上,两端都是平末端,始终连不上,不知

来源：学生作业帮编辑：灵鹊做题网作业帮分类：综合作业时间：2024/05/01 05:30:40

平末端连接问题
最近在做载体构建,有一个5k左右的片段要连接到一个12k左右的载体骨架上,两端都是平末端,始终连不上,不知道连接体系需要怎样的优化,连接酶要多,但是一个10ul的体系中,到底要加多少酶?以及目的片段和载体各是多少才合适?没做过,身边的人也没有经验,做的非常辛苦啊~
载体已经去磷酸化处理

二楼正解.不过你的T4 ligase浓度是多少?你的insertion DNA 和 vector浓度又是多少?一般来说商业用T4 ligase不会少于20,000u/ml,你的insertion size又有5k,还需要10：1于vector的比例加入到10ul反应体系当中去,0.5ul酶应该足够用了.
看你连接连得那么辛苦,给你介绍一个新朋友吧,不是双汇火腿肠,而是clontech的In-fusion protocol.不过不知道国内有没有卖这种试剂盒的哈,去年的技术...
http://clontech.takara-bio.co.jp/manuals/pdf/PT4065-1.pdf

平末端连接问题最近在做载体构建,有一个5k左右的片段要连接到一个12k左右的载体骨架上,两端都是平末端,始终连不上,不知为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接,酶切的图示 DNA连接酶把目的基因与载体的黏性末端的碱基对连接起来, 关于克隆的问题.假如我有有一个基因片段,未知序列.我可以把它连接到T载体,然后PCR 双基因载体连接需要将两个不同的基因同时连接到一个载体上,一般而言,是先将其中一个基因和载体相连,再将另一个载体和其相目的基因片段与载体DNA连接的主要有? 1.在基因工程中,目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接是指什么? 目的基因导入受体细胞是怎样进行的?如何防止目的基因与质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接?请关于载体构建的问题我要构建一个GFP表达载体标记人体骨髓间充质干细胞的黏着斑,我想问一下这个载体的目的基因怎么获得?质粒冈崎片段为什么要用DNA连接酶连接?DNA连接酶不是只作用于平末端或者粘性末端吗? 构建载体的时候,先用设计好的引物PCR所要的目的基因,再和T载体连接,再转化,再小抽,再双酶切,再和 T4连接酶可以连接平末端,一样可以连接粘性末端,好像比DNA连接酶厉害的感觉,为什么通常都用DNA连接酶?