关于PCR克隆基因的引物问题

来源：学生作业帮编辑：灵鹊做题网作业帮分类：语文作业时间：2024/05/01 11:22:21

关于PCR克隆基因的引物问题
想拿到一个基因的CD区,CD区一共1400bp,用引物A（上游引物）,B（下游引物）扩出了1-1200bp前面一段,引物C（上游引物）,D（下游引物）扩出了1000-1400bp后面一段,可是用A和D做引物PCR什么条带都没有,甚至连引物二聚体都没有...用primer5分析这对引物虽然得分不高,但也还算可以,毕竟这两个引物和别的引物一对的话还是能扩出来的...请大家帮忙分析一下原因,是否还有必要继续摸索条件用这对引物继续扩完整CD区...跪谢...TT

你看,你分别获得了1-1200 nt以及1000-1400 nt这两段序列,那么中间有200 bp长度的序列是重叠的,对吧?也就是说你已经从序列信息上获得了这个CD区所有的序列信息.如果你只是需要序列信息的话,已经足够了,但是如果你需要扩增得到这完整的1400 bp用于后续的实验,那么你需要继续扩增完整的CD区.
如果这样的话,我有个小窍门,你可以把1-1200 nt以及1000-1400 nt这两个片段混合和作为模板,然后利用引物A和D进行扩增,很容易就能得到完整的1400 bp产物,不过前提是你第一步变性退火的时候,时间适当的长一些,让这两个大片段能够混合退火,即让两个片段重叠的200 bp部分能够退火,便于你扩增.
再问：啊！大神，等的就是你...一直觉着怪怪的，总觉着得有个神马小窍门之类的...TT...我觉着变性时间不用改吧，还是30秒，主要是退火温度应该延长吧，200个bp退火温度延长到1min 30s够么？这样会影响别的地方吗？再次跪求大神指点
再答：第一步94度变性的时候用15分钟，之后的程序不用特别调整，每一步变性退火都不用太长，变性我平时都用不到30秒这么长，退火1分30秒不必，就普通的退火时间就好了。其实就是第一步预变性的时候充分一些足矣，你先试试这个方法吧，应该没问题。
再问：为什么预变性要这么长时间啊？预变性不是打开双链结构的作用么？检菌的时候预变性才10分钟呢！这个就这两个片段按理说不应该这么长时间打开双链结构啊
再答：预变性长一点是经验，理论上也没有太大意义，这种反应我都是预变性15分钟，效果不错，我的理解是时间长一些能够让双链彻底打开，同时均匀分布于整个体系，后续不是需要混合退火嘛

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