连接反应产物,是否可以直接做PCR模板?要不要先灭活其中的T4连接酶?

来源：学生作业帮编辑：灵鹊做题网作业帮分类：综合作业时间：2024/05/14 07:55:39

连接反应产物,是否可以直接做PCR模板?要不要先灭活其中的T4连接酶?
我手头上有六段DNA片段（假定分别为A,B,C,D,E,F),每个片段大约30-40bp左右.每个片段两端均为粘末端,其中A与B,B与C,C与D,D与E,E与F的粘末端可以互补匹配,并且是唯一的匹配（举例：A的粘末端仅与B的匹配,而不能与C,D,E,F的匹配,等等）.我的想法是用T4连接酶一次性把这6段DNA片段连接成约200bp左右的长片段,然后在长片段两端设计两个PCR引物进行扩增.然后将PCR片段割胶回收,然后双酶切,最后连接到经过了同样双酶切的质粒中.请问这样的思路是否可行,其中有什么地方要注意?还有就是上面的连接反应产物是否可以直接用来做PCR?,要不要先灭活其中的T4连接酶?

这样做实际上是不可行的,效率会很低.我以前也想你一样试过.
原因：粘性末端相连的机会不大,而且要6个同时都相连,机会是呈指数级别下降的.而且如果直接做PCR的话,那些没有连接或者部分连接的片段十个极大的干扰.
2个方案：既然酶切位点独特,建议把A和F修改为直接可以和质粒互补的末端,连接后直接克隆.比做PCR的可能性要大.
或者先做AB, CD, EF连接,克隆后再做两次ABCD+EF连接.

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