我做质粒的单酶切、与目的片段连接、转化,老是没有菌长,转化过程、感受态没问题,

来源：学生作业帮编辑：灵鹊做题网作业帮分类：综合作业时间：2024/04/20 00:02:01

我做质粒的单酶切、与目的片段连接、转化,老是没有菌长,转化过程、感受态没问题,
我怀疑是连接的问题,现在我直接把质粒酶切回收后不加目的片段,直接让它自连,也不长菌,开始用的Fermenters的T4连接酶,换了种还是没长,我实在不知道什么原因,向大家求救,已经做了好久了,快崩溃了.

你确定转化过程和感受态没问题吗?有没有做过平行的其他转化对照?如果别的质粒可以转进去,并且生长,则确实说明你的转化过程和感受态没问题.
如果是这种情况,那么问题有可能是在酶切后回收这一步.回收后的DNA质量直接影响到之后的T4连接酶作用和细菌转化.包括酶切回收buffer没有洗脱干净,或者留有酒精（对连接酶来说是比较致命的一点）,或者最后的溶解buffer的酸碱值有问题,都会影响到细菌接受质粒的.建议你重新换一个酶切回收试剂盒.并且每一步都做好平行对照.查找出问题所在.
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质粒和目的基因片段分别双酶切（bamh1,xba1）连接后电转感受态细胞,同时将质粒酶切回收的片段转化做对照切开的质粒能转化进入感受态细菌吗为什么我的目的基因连接克隆载体转化、提质粒后,酶切鉴定正确,而质粒PCR和菌液PCR鉴定都不正确呢?着急最近做了连接转化,挑平板上的菌落摇菌后提质粒,单酶切可以切开,而且质粒的大小明显小于空质粒您好,将目的片段连接T载体后为什么要作感受态?目的是什么?T载体就是质粒吗,属性是什么? 大肠杆菌感受态转化的原理是什么? 将目的基因与质粒结合的过程中,是不是必须将目的基因的两端与切开的质粒两端都完全连接才可以呢? 目的基因片段与载体质粒的选择? 感受态的制备我制备的感受态加DMSO放-80最近转化率总是下降不知是什么原因, 质粒转化农杆菌感受态后,挑斑摇菌菌液PCR后无条带. 做感受态转化冰浴30分钟要注意什么质粒与目的基因的连接产物是?