rt完浓度高内参扩不出来-搜答案-灵鹊做题网

我也遇到过这种问题,个人觉得可能是目的基因的定量引物不好,还有就是要优化PCR条件!

上下引物的Tm最好相似,不能差异太大,不然不好设计退火温度；内参条带很亮,说明RT应该没多大问题,问题可能出现在PCR上.没有目的基因是因为1该基因确实不表达；2你的引物不特意,到NCBI的Prime

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一般认为一些持家基因的表达量在不同状态下变化不大,所以可以认为它们表达是恒定的,故而用来做内参简而言之,就是你有两个样品（譬如不同生长条件或者不同组织的）,要比较其中某基因A表达转录变化,就分别比较两

内参的选择：普通PCR内参的大小没有多大要求,但realtime一般选择300bp以下它的作用在于你提取的RNA逆转录成cDNA时,加入的浓度可能会不一致,即使用分光广度计测其浓度,也会有仪器误差.P

啥都没有的话是无法设计的首先你可以克隆获得内参的序列,再进行下一步实验再问：如果是想用18srRNA这个内参，我该怎么设计引物来得到这段序列呢？再答：这个在各个物种中的同源性很高的，你可以直接用其他物

要回答这个问题必须看你引物的序列.你贴出来我帮你查一下,你自己也可以BLAST一下.如果在人和鼠的基因中都可以BLAST到,则可以用,否则就不可以.虽然这些HouseKeeper基因的同源性很高,如果

你说的应该是realtimePCR吧,注意RT其实是逆转录reversetranscription的缩写,和realtime一定要分开来.常说的qPCR,qRT-PCR,都是通过实时（realtime

这是由你设计的引物决定,一般控制在200bp以下为佳.包括你要检测的目的基因,设计的片段长度也控制在200bp以内.保证扩增效率较为一致.

问题有可能如下：1）模板制备有问题.你可以用普通PCR扩增,然后电泳确定是不是模板有问题?2）引物问题：引物设计的好与否,对Realtime结果至关重要!可以用普通PCR确定你的引物扩增效率如何?模板

提交不了答案.不要调一致把内参也检测了

为啥要把内参调一致呢你每次都也检测一下内参不就好了然后用目的基因的比上内参一般很少有什么调一致的吧.

RT-PCR就是将RNA先反转录为cDNA,在将转录得到的cDNA作为模板进行PCR反应扩增目标片段.用于反转录的引物根据实验的具体情况选择随机引物、OligodT及基因特异引物的一种.对于短的不具有

1、内参没有被扩增出来2、电泳时内参没加loadingbuffer或染料

actin如果都扩不出来那不是反转有问题就是RNA已经降解了.建议检查这两步的样品.建议检查程序,重新反转,如果还是扩不出来的话,重新抽RNA,再不行,回家过年吧.

esolve

我不了解你的实际情况,我给你几条建议：1.可能是内参引物有问题2.你扩增内参基因的PCR条件设计可能有问题,如Tm3.你用的是一块胶吗?加核酸染料了吗?

上样太多了,每孔里面没必要上那么多样品,你上样之前应该定下蛋白或是用Nanodrop测下蛋白浓度

楼上的大哥,我的神啦,内参如果不是用同样退火温度,不是跟被测基因同时p的话,还好叫内参的吗?不过这得怪楼主没有说清楚,RT是反转录还是说realtime的定量PCR啦?如果是反转录的话,好像是叫loa

内参就是在cDNA里面的啊比如你有三种反转录的cDNA就分别用内参的引物做三组和目标基因一起做就行了不过是要单独加不是和目标基因的引物加在一个孔里

rt完浓度高 内参扩不出来